选自中华检验医学杂志, 2018,41(5)

作者：肖林林 杨德平 魏取好 刘维薇

近年来，分子诊断领域的发展遇到前所未有的契机，加之国家相关政策的制定与倾斜，更使其蓬勃发展。分子诊断以其快速、灵敏、精准的特点在疾病发生、发展、预后等各个阶段均可发挥一定的作用而使其在医疗行业中得到了较广泛的认可。

 

一

分子诊断及分子诊断自动化概述

分子诊断是应用分子生物学的技术和方法获得人体生物大分子及其体系存在结构或表达调控的变化水平，为疾病的防治、预测、诊断、治疗和预后判断提供信息和决策依据的新兴的检验医学分支学科^[1,2,3]。自20世纪70年代起，分子诊断领域的研究异军突起、方兴未艾，其迅速成为体外诊断最重要的领域之一，是体外诊断领域中技术要求最高、发展最快、最富有挑战性的一个分支^[4]。分子诊断的发展史可分四大阶段：1978年，简悦威等应用液相DNA分子杂交成功地进行了镰形细胞贫血症基因诊断，标志着分子诊断的诞生；到1985年，Kary Mullis博士发明PCR技术，标志着分子诊断进入了第二阶段；1992年，美国Affymetrix公司制造出第一张基因芯片，标志着分子诊断进入生物芯片阶段；2005年，454 Life sciences公司推出基于焦磷酸测序法的测序系统，开创了第二代测序技术的先河，分子诊断进入精准检测的高通量时代，应用范围进一步扩展。

国内分子诊断技术的发展历史依然遵循着世界分子诊断发展的大方向，大致分为以PCR技术为基础的萌芽阶段，以实时荧光定量PCR技术、芯片技术为基础的发展阶段，以及以高通量测序、微滴式数字PCR和液体活检等技术为基础的黄金时代三个阶段^[5]。常规体液标本逐渐被赋予新的内容，循环肿瘤细胞(circulating tumorcell，CTC)、循环肿瘤DNA(circulatingtumor DNA，ctDNA)、外泌体(exosome)等遗传信息载体的发展日新月异，令人充满无尽的遐想^[6]。目前国内分子诊断主要涉及的技术平台及其应用领域具体见表1。

表1 国内分子诊断主要涉及的技术平台及其应用领域（点击看大图）

 

分子诊断自动化即全自动化集成式的分子诊断系统，主要包括样本采集、样品处理(细胞浓缩、细胞破碎)、核酸提取(DNA/RNA分离等)、基因扩增、产物检测(实时荧光定量、核酸杂交等)等检测过程。由于分子诊断中样本预处理过程复杂，常需精确的温控系统，手工较难实现，分子诊断自动化系统便应运而生。其以通量大，重复性好、高效、封闭体系防污染、可实现精确的温控及复杂的预处理过程，对实验场地要求不苛刻等优势而备受关注。

 

二

分子诊断自动化系统的基本组成

及其应用现状

1．分子诊断自动化系统的基本组成：

依据功能分为3部分：样本前处理系统、检测处理系统和分析处理系统，各个子系统由相应的软件和硬件紧密结合而成。系统涉及的关键技术包括：样本提取和处理技术、目的分子的获取与放大技术、信号检测技术和数据分析与人工智能辅助诊断技术。

 

 

分子诊断自动化的发展程度与仪器实现自动化检测过程覆盖的范围密切相关，若将样本前处理自动化系统称之为分子诊断自动化的1.0时代，那么样本提取检测一体化系统可以称之为分子诊断自动化的2.0时代，样本提取检测分析一体化系统可以称之为分子诊断自动化的3.0时代，期望可以实现分析全过程的自动化处理，此外还可以利用人工智能实现报告综合分析自动审核、辅助诊断、个体化诊疗方案及预后提示、自助进行临床大数据分析及疾病建模研究，我们姑且称之为分子诊断自动化的MAX时代。

 

2．核酸提取的应用现状：

分子诊断研究的靶样本种类繁多，包括核酸、蛋白质、外泌体、细胞、组织等，临床分子诊断现阶段的研究对象集中于核酸。核酸提取技术是其涉及的关键技术之一，除包括常规DNA、RNA提取外还包括、ctDNA、血液游离DNA(cell-free fetal DNA，cfDNA)、微小RNA(micro RNA，miRNA)等特殊靶样本的提取，从样品中提取核酸的方法有很多种，其中，磁珠分离法是目前应用最广、运用于自动化处理系统中最为成熟的一种方法^[7]。由于ctDNA、cfDNA在外周血中含量极低，因此对于提取、检测技术有很高的要求。目前ctDNA、cfDNA的检测主要包括分离富集和检测。富集方法包括梯度密度离心法、过滤法和磁珠法(最常用)，检测方法包括免疫学相关技术、反转录聚合酶连锁反应技术、酶联免疫斑点技术以及芯片技术。分离提取miRNA的主要方法有：差速离心法、超滤法和免疫亲和层析法，各有优缺点，采用多种方法联合应用分离提取miRNA，可提高产物纯度，稳定生物活性。

 

3．国内外分子诊断自动化系统的应用现状：

1980年世界上第一台临床自动化样本处理装置的投入使用，标志着临床实验室正式步入自动化时代。随着时间的积累和技术的渗透，临床分子诊断自动化拉开序幕。目前已面世且获得CFDA及FDA认证的各平台中，样本提取检测一体化平台仅有罗氏公司推出的cobas® AmpliPrep/cobas® TaqMan® with Docking及cobas® s201全自动核酸血液筛查系统两款产品，基本实现了"样本进、结果出"的效果，因为实验全程*作标准化、空间封闭，故可以做到低污染、高效率、高重复性，但平台兼容性和可扩展程度较低，检测项目有限。国内分子诊断自动化产品的开发起步相对较晚，目前还没有国内公司推出具有自主知识产权的样本提取检测一体化产品。国内分子诊断设备公司为寻求自身发展，但苦于资金和技术等方面的限制，大多选择和国外领先技术公司合作，以期在国内迅速占领市场。博奥生物等公司先后推出过自动移液工作站、核酸提取仪、PCR仪等临床分子诊断类产品，一定程度上填补了国内空白，但自主知识产权或技术含量不高、功能单一、市场占有率低是不争的事实，需要再接再厉。

 

三

分子诊断自动化主要技术参数

绝大部分公司推出的分子诊断自动化产品均主要集中于样本前处理阶段，就目前阶段而言，无论是国内还是国外发达国家，分子诊断自动化仍然处于1.0时代，故以下我们将集中阐述样本前处理自动化系统的技术特征。

 

样本前处理系统依据其功能的丰富程度又包括自动移液工作站和自动核酸提取仪两类平台。自动化移液工作站是一种全自动、高精度移液系统。专门用于小体积的PCR/qPCR体系配置，能够完全替代手工，保证了配置实验扩增体系的正确性，精密度以及重复性，但是因为功能单一，临床及科研应用局限。自动核酸提取仪是集成了自动移液工作站和标准耗材，在仪器预设程序控制下进行核酸分离的仪器，这一类自动化系统在科研和临床中应用最为广泛，目前评价分子诊断样本前处理系统的主要参数见表2。

表2核酸提取仪技术参数一览表（点击看大图）

 

四

分子诊断自动化的发展瓶颈

分子诊断自动化系统看似完美，实则也有制约其发展的缺陷和瓶颈，主要体现在以下几个方面。

 

1．分子诊断自动化系统的技术瓶颈：

核酸提取过程的精简化造成的检测结果的保真性及可信度降低是分子诊断自动化的技术瓶颈之一。向自动化发展的过程中，检验流程的精简化需求促使核酸提取过程的简化，导致核酸样本中后续实验抑制物残留增多，实验效率受到影响，结果保真性及可信度降低。

 

2．平台的开放性、兼容性不够：

目前市场上开发的各种分子诊断自动化平台之间壁垒森严，不同厂家之间的产品不能兼容，配套的非试剂类耗材的成本居高不下，自动化平台还没有形成统一的行业标准等。

 

3．样本检测通量有限：

虽然分子诊断领域出现了诸如基因芯片、测序技术等高通量技术，但样本检测通量和传统的生化、免疫类自动分析仪相比较相距甚远，严重制约分子诊断自动化的发展。

 

4．国内相关法律法规的制约：

国家卫生计生委已经发布了《医疗机构临床检验项目目录(2013版)》和《非营利性医疗服务项目(2013版)》，分子诊断收费项目包含齐全，各省也已颁布或正在加紧制订收费标准，但是项目收费标准制定相对于分子诊断技术的发展还稍显滞后，收费规定不尽合理，比较笼统，不便于临床实际执行。其次，即使目前有明确清晰的收费标准，医保部门联动响应力度不够，导致患者存在检测费用的医保难以报销的制约。收费标准和医保措施限制了分子诊断及分子诊断自动化的应用和发展。

 

5．软件不匹配、不同步：

分子诊断自动化领域硬件平台趋于同质化，功能齐全、处理能力强大的配套软件可以达到全程可视化、管理科学化、工作高效化、结果共享化、成本控制化等效果，可能会成为抢占市场有力的武器。分子诊断自动化系统配套的软件可以分为三个部分：人机交互及机电控制软件、运行管理及数据采集软件、数据存储整合分析软件，分别与分析前、中、后过程的硬件配合发挥作用。前两部分技术含量不高，目前应用广泛，第三部分主要用于自动化质量控制及智能化判断、采集的数据进行计算和输出，甚至是进行生物信息学分析进而做出个体化检验诊断提示、构建基于网络的智能分子诊断平台进行人工智能辅助诊断和对大数据分析进行临床研究等，目前处于探索阶段，其技术含量最高，应用价值也最大。

 

五

分子诊断自动化的展望

1．人工智能：

近十年兴起的微阵列芯片和二代测序等代表性技术，已经成为一种重要的分子诊断工具，为这些代表性技术的产生和发展提供强大支撑的学科就是人工智能。人工智能对分子诊断领域发展的具体影响已经或将会体现在以下几个方面：(1)快速筛选相关疾病更加有效的诊断靶点；(2)使分子诊断结果更加高效、快速、准确和可视化；(3)优化计算方法，提高测试重复性和精密度；(4)大数据与分子诊断预测；(5)模型重建与结果的深度解读和挖掘等^[8]。

 

2．POCT：

分子诊断自动化行业呈现出"战国争霸"的局面，但结合POCT的分子诊断继承了自动化系统优势的同时，解决体积大、流程繁杂的缺点，在未来的分子诊断领域必将独领风骚，原因有以下几个方面：(1)个体化、快速化、样本少量化、装备一体化、床旁化、设备小型化、手机化、APP软件化特点的POCT式分子诊断是大势所趋；(2)芯片技术在POCT上的应用使POCT式的分子诊断临床优越性突出，领域越来越宽；(3)国家政策支持：科技部、卫生部制定的专项规划中均明确提出"积极发展现场快速检测仪器(POCT)等新产品"；(4)POCT市场规模不断扩大且保持30%的高速增长，预计到2020年产业规模可达1200亿元，将进一步催化POCT与分子诊断的整合。

 

3．精准医疗：

谈精准医疗离不开精准诊断，分子诊断是实现精准诊断的重要方法和途径。精准医疗为分子诊断及分子诊断自动化带来的机遇主要体现在以下方面：(1)我国精准医学研究计划的实施为该领域配套研究提供了政策支持；(2)分子诊断自动化是一个涉及多专业多行业的复合型应用平台，巨额资金的投入为相关学科和技术的快速发展提供了有力保障。

 

4．行业技术水平：

技术层面的发展将呈现出"统一化""集成化""微型化"的态势。"统一化"指的是从行业层面制定规范、统一、适宜的行业标准。CLSI已经开始致力于制定分子诊断自动化设备的行业标准。"集成化"和"微型化"是利用微电子、微流控等新兴技术达到使系统空间上缩小集成，功能上放大可扩展的效果，多学科交叉、高含金量技术叠加是必然趋势^[9]。

 

5．行业管理水平：

管理层面所面临的问题主要在于管理体系的制定、完善和实施，完善体系，分子诊断蓄势待发。随着国家政策的不断完善、卫生监督部门对分子诊断重要性认识的不断深入，管理水平的提升也会使分子诊断自动化在未来出现革命性的进步。当前发展阶段解决问题的关键是在规范各项规章制度的前提下，建立国家和区域标准化分子诊断实验室和标准化自动化*作程序(包括分析前、分析中、分析后)，尽早制定出一个符合中国国情的分子诊断自动化监管体系^[10,11]，使我国分子诊断事业朝着健康有序的方向发展，更好地为临床患者提供高质量的分子检测服务。