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产品性能评估是产品研发、制定产品标准等过程的重要技术支持研究过程，并可能对产品的质量造成一定的影响。

 

目前国际上对体外诊断试剂的性能评估通常是以美国临床实验室标准化组织（Clinical and Laboratory Standards Institude以下称为CLSI）的相关标准为依据，也是美国FDA推荐采用的评价标准。

 

美国临床和实验室标准协会

• CLSI是美国【临床实验室标准化协会】的英文缩写，英文名为Clinical and Laboratory Standards Institute。
• CLSI前身是NCCLS【美国临床实验室标准化委员会】，英文名为National committee for clinical laboratory。
• 美国CLSI的抗微生物药物敏感性试验*作方法和判断标准，是国内临床细菌检验遵循的标准。由于制订该项标准需要投入大量的人力、财力和物力，所以大多数国家都还没有能力建立自己的标准而依赖CLSI的方法和标准。CLSI标准每年更新！
• EP系统文件，在实验室工作中常常会应用。所有这些标准和指南对制定我们临床检验的标准型文件会有很大帮助。

 

性能评价的标准

体外诊断试剂产品性能评估包括检测限、线性范围、可报告范围、准确度（回收实验）、准确度（方法学比较）、精密度、干扰实验、稳定性、参考区间共九个项目。

Trueness / Comparability （准确度）

• EP09-A3, Method Procedure Comparison and Bias Estimation     Using Patient Samples; Approved Guideline—Third Edition
• EP15-A3, User Verification of Percision and Estimation of     Bias; Approved Guideline—Third Edition.

Precision （精密度）

• EP15-A3, User Verification of Percision and Estimation of     Bias; Approved Guideline—Third Edition.
• EP05-A3, Evaluation of Precision Performance of Quantitative     Measurement Procedures; Approved Guideline—Third Edition.

Linearity （线性）

     EP06-A, Evaluation of the Linearity ofQuantitative Measurement Procedures: A Statistical Approach; ApprovedGuideline.

Limit of Detection / Quantitation （检测限）

      EP17-A, Protocols for Determination ofLimits of Detection and Limits of Quantitation; Approved Guideline.

Reference Interval （参考区间）

EP28-A3C, Definingand Verifying Reference Intervals in the Clinical Laboratory; ApprovedGuideline—Third Edition.

Qualitative Comparability （定性可比性）

EP12-A2, User Protocol for Evaluation ofQualitative Test Performance; Approved Guideline—Second Edition.

Diagnostic Accuracy （诊断准确性）

       EP12-A2, User Protocol for Evaluationof Qualitative Test Performance; Approved Guideline—Second Edition.

Qualitative Precision （定性精密度）

      EP12-A2, User Protocol for Evaluationof Qualitative Test Performance; Approved Guideline—Second Edition.

 

检测限（ EP17-A ）

概述

检测限评估资料是评价拟上市产品有效性的重要依据，也是产品注册所需的重要申报资料之一。

空白限值： Limit of  Blank（ LoB ）

检出限值：Limit of  Detection (LoD)

定量限值： Limit of  Quantitation (LoQ)

各种限值之间的关系

• 最低的是空白限值（LOB）：是不含有待测物的可能检测的最大浓度；
• 其次低的是检出限值（LOD）：是可能大于LOB的可被检出的实际浓度；定量限值（LOQ）：能够被可靠检出的最低实际浓度。（目前接受度很低）
• LOB≤LOD ≤ LOQ
• 极限建立顺序：LoB → LoD → LoQ 

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建立和验证LoB测量程序

• ISO默认α=β=5%，5%α值相当于空白值分布的95%，作为显著高于空白的检测值的限值，由空白值呈正态分布，此限值相当于：

LoB=μ_B + 1.645σ_B  

注：μ_B即平均值，σ_B即SD                         

• 样本数目：建立需要每个水平≥60个结果，验证每个水平≥20个结果
• 正态分布数据使用公式（1）

LoB=μ_B + 1.645σ_B （1）

注：μ_B即平均值，σ_B即SD

• 偏态分布数据使用公式（2）

LoB=PctB 100-α  （2）

样本选择

• 应尽可能做到，空白与低水平样品为天然样本，或与天然样本具有可替换性。
• 为确保检测具代表性，应对一组样品作检测，而非对单一样品进行检测。鉴于基体差异，最好对5个以上样品作重复检测。
• 作为内源性化合物，空白样品为去除组分的样品，如：用抗体沉淀、酶降解、活性炭吸收等
• 作为低水平内源性化合物，可使用一系列在低范围浓度的样品，若有必要，可配制成有分析物的样品，最好配制一组来自不同个体的系列样品。以综合标准差估计来自样品组的重复检测变异。

建立和验证LoD测量程序

Ø若低水平样品检测结果呈正态分布，其分布的5%（β）百分位数相当于LoB：

LoB=μ_S - 1.645σ_S   注：μ_s即平均值，σ_s即SD

即μ_S =LoD=LoB +1.645σ_S   ，从而            

LoD=μ_B + 1.645σ_B + 1.645σ_S                                  

• 样本数目：建议选择4-6个水平，建立需每个水平≥60个结果，验证需每个水平≥20个结果
• 确定LoB后，一般认为LoD的浓度范围近似于LoB到4倍LoB间，在此范围内选择一系列样品，先测定一个实验性的LoD_T；如果测定的SD满足目标条件，则LoD= LoD_T，如果不满足条件，则选择更高的浓度重新测定。
• 正态分布数据使用公式（6）

LoD_tent=LoB +c_βSD_S （6）

注：c_β=1.645/(1-1/(4*f))；f =Ns-K,即自由度

• 非正态分布数据：可尝试转化为正态分布，例如取对数。如无法转换，但SD近似常数，使用公式（7）

 LoD=LoB + D _S，β （7）

注：D _S，β  类似cβ，根据β误差范围划分，一般取95%的数据>LoB为置信范围。

• 如SD不近似常数，再次选择浓度水平反复进行实验，直到符合上面的任何条件为止。
• 根据实际需要先确定精密度目标范围，一般CV<20%
• 样本数目：需要每个水平≥40个复孔结果，至少选择3-5个样品浓度水平，平行测定5次。验证LoQ需要n≥25个复孔。
• 每个样品的40个复孔总标准偏差用于建立精密度。
•  一般总误差( Total)=偏差+2*SD_s
• 可利用合适的参考物质建立LoQ，将参考物质添加或稀释以得到真实浓度。

举例说明（某产品为例）

产品标准	性能考核LOB	性能考核LOD
不高于1.5U/ml	1.5U/ml	0.8U/ml（112%）
		1.2U/ml（50%）
		1.6U/ml（55%）

• 验证LOD所用稀释液为SeraconⅡ的血清（添加抗原）
• 验证LOB所用稀释液为校准品稀释液（空白样本）
• 样本的制备很重要

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线性范围

概述

• 线性范围评估资料是评价拟上市产品有效性的重要依据，也是产品注册所需的重要申报资料之一。
• 参考《EP6-A 定量测量方法的线性评价》。

基本要求

• 无论是建立或验证线性范围，所选用的浓度水平应可覆盖整个预期测定范围并包括与临床有关的重要评价浓度，如最小测定浓度或线性范围的最低限、不同的医学决定水平、最大测定浓度或线性范围的高限等。
• 目前验证线性范围，将测定范围加宽至130%，在此范围内选择6个浓度水平。

实验过程

• 建立线性范围：需测定9-11个浓度水平，每个浓度水平重复测定3-4次。
• 验证标称线性参数：需测定4-6个浓度水平，每个浓度水平重复测定3-4次。

结果处理

• 依据6个样本的实测浓度以及稀释比例进行线性做回归分析，计算回归系数。
• 根据回归方程计算6个样本的理论浓度，计算实测浓度与理论浓度的偏差。
• 具体标准参照各试剂盒性能指标。

举例说明（CA125）

	产品标准	性能考核
范围	1.5U/mL～5000U/mL	1.05U/ml～6500U/mL

 

	评估资料		性能考核
	CA125-L7	定标品稀释液	L1	L6
L1	0.1%	99.9%	100%	0%
L2	0.5%	99.5%	80%	20%
L3	5.0%	95%	60%	40%
L4	15%	85%	40%	60%
L5	30%	70%	20%	80%
L6	60%	40%	0%	100%

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检测值	理论值	偏差	产品标准	是否通过
6.61	-17.97	-24.58	不超过±30U/mL	是
778.9	883.3	-13.4%	不超过±15%	是
2135	2146.3	-0.53%	不超过±15%	是
3167	3309.3	-4.30%	不超过±15%	是
4679	4472	4.62%	不超过±15%	是
5602
线性相关系数r=0.9967			线性相关系数r ≥0.99	是

 

准确度

概述

准确度评估资料是评价拟上市产品有效性的重要依据，也是产品注册所需的重要申报资料之一。定量检测方法的回收实验是评估准确度的方法之一，用于评估定量检测方法准确测定加入纯分析物的能力，结果用回收率表示。

评价依据

• 国际（或国家）标准品或自制定值样本比对
• 准确度样本进行回收实验
• 临床样本比对

实验过程

• 将国际（或国家）标准品或自制定值样本稀释成理论浓度，与实测浓度进行偏差分析
• 自制回收率样本1和2，将1和2按照比例进行混合，得到回收率样本3，根据实测浓度计算回收率
• 不同浓度临床样本40个，每天随机选取8个样本进行测试，持续5天，进行相关性分析

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准确度（CEA）

		回收率	产品标准
回收A	90.39	108%	85%～115%
回收B	2.55
回收C	13.85

 

	测值	定值	偏差
WHO-1	10.12	10	1.20%
WHO-2	100.1	100	0.07%

 

精密度

概述

• 精密度评价实验的主要目的是评价独立实验室内的单个仪器所用的方法以及仪器的精密度。直观的，精密度是无限制的长期使用某一仪器的变异性。通常，设计一个实验，如果所有的因素都可以影响室内精密度评价而不用考虑每一因素或成分的相对大小，这就足够了。描述与时间相关的精密度组成部分的名词包括：重复性、批内精密度、日内精密度、日间精密度、室内精密度。

实验过程

• 配置低、中、高样本，连续进行20天重复测试，计算变异系数
• 目前KHB试剂盒质检：重复性样本各测试10次，计算变异系数

注意问题

• 样品一定要稳定，且应与新鲜的临床病人标本性能接近，稳定的冷冻混合血清是首选
• 样本中的分析物含量应在该项目的医学决定水平处，尽可能做两个水平以上的精密度实验
• 采用冷冻保存的样品一定要注意内含分析物的稳定，要严格控制冷冻、混匀的*作

精密度（CEA） 

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产品标准	性能考核L	性能考核M	性能考核H
CV不大于8%	4.5%	4.8%	3.4%
M样本由L和H同体积混合而成

 

干扰实验

概述

干扰物质是体外诊断试剂使用过程中造成测量误差的一个主要原因，针对体外诊断试剂进行的干扰实验是指通过实验查找出对体外诊断试剂测量结果产生影响的物质的过程。干扰实验评估资料是评价拟上市产品有效性的重要依据，也是产品注册所需的重要申报资料之一

 

干扰物质来源

• 常见的异常标本，例如溶血、黄疸及脂血；
• 普通的处方药及非处方药；
• 患者群体中异常的生化代谢物；
• 患者群体中常见的治疗药物；
• 干扰测量程序的药物（包括代谢物）；
• 已报道干扰相似测量程序的物质；
• 标本处理过程中的添加物，例如抗凝剂、防腐剂；
• 采集及处理过程中接触标本的物质，例如血清分离设备、导管、标本收集容器及塞子；
•  影响某些实验的膳食物质，例如咖啡因，β- 胡萝卜素，罂粟籽

干扰实验的评估

干扰物质对实验结果的影响，一般是通过测定对照或基础样本池中待测物的浓度计算得出的。在某些情况下，对照样本池中可能含有一定量的内源性干扰物质，如胆红素、血红蛋白、蛋白质和脂类。在一些测量程序中，采用标本前处理、样本空白、血清基质校正物和因子校正等手段以减少这些干扰物质在平均浓度下的影响，只有当患者样本中干扰物质浓度高于或低于平均水平时，由于干扰物质引起的误差才会显现出来。

基于此，有两种评估干扰物质的基本方法，每一种方法都有它的优点及内在局限性，当两种方法同时使用时，可提供相互补充的信息。一种方法是将可疑干扰物质加入样本以评价干扰效果，另一种方法是测量个别有代表性病人标本，相对于高特异性可比较的测量程序评价被分析测量程序产生的偏倚。 

 

实验准备

• 基础样本池：从一些未服用药物的健康个体获得新鲜标本，以此反应标本基质。若不能获得新鲜标本，可使用冷冻或冻干的标本代替，但应保证实验材料充分接近新鲜临床标本。使用适当纯度的分析物将样本池中分析物的浓度调整到医学决定水平，但要避免引入其它的干扰物质。
• 储存溶液：准备一种适当纯度或者最接近循环形式的可疑干扰物质。制备至少20倍干扰物实验浓度的储存溶液。
• 评价偏倚，结果可能为正偏倚、负偏倚或无偏倚。将实验标本与对照标本的结果比较，评价它们之间是否存在系统偏倚，如果存在系统偏倚，计算实验组偏倚的上限与对照组的平均偏倚的差值，此值与干扰标准相比较，以评价是否存在有临床意义的干扰。 

 

胆红素（浓度）		血红蛋白（浓度）
评估资料	性能考核	评估资料	性能考核
0	0	0	0
150	400	250	800
300	600	500	1000
450	800	750	1200
600		1000

 

乳糜颗粒（%）		RF（浓度）
评估资料	性能考核	评估资料	性能考核
0	0	0	0
0.25	1.00	500	800
0.50	2.00	1000	1000
1.00	3.00		1200
2.00

 

ANA（滴度）
评估资料	性能考核
0	0
80	120
160	140
	160

 

样品名称	终浓度	浓度值	偏差
胆红素Ser-L1	0	10.52	／
胆红素Ser-L2	400	12.23	16.24%
胆红素Ser-L3	600	11.46	8.87%
胆红素Ser-L4	800	11.33	7.69%
胆红素Ser-H1	0	91.77	／
胆红素Ser-H2	400	105.2	14.61%
胆红素Ser-H3	600	99.84	8.79%
胆红素Ser-H4	800	100.4	9.44%

 

结论

性能关乎着产品的质量，做好性能评估对于研发一个好产品来说至关重要！